Una bióloga en la cocina.

Hibridando y transfiriendo según los puntos cardinales: repaso histórico al origen de la técnica de Southern, Northern y Western blotting.

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Volvemos a retomar la sección más histórica del blog, con una entrada dedicada al origen y evolución histórica de una de las técnicas que más migrañas y dolores de cabeza da a los pre-docs, post-docs o técnicos de laboratorio en el estudio de la bioquímica y biología molecular: la northern-blot, la southern-blot y la western-blot. Todas ellas son técnicas de hibridación con un nivel de ejecución que requiere ciertas habilidades y sobre todo, cierta paciencia pues, no siempre sale el resultado que un@ se espera. A pesar de ello, son una de las técnicas de rutina más habituales en el trabajo diario de los laboratorios de análisis molecular, por lo que considero que es necesario hacer un pequeño homenaje a su creador (aunque muchos se acuerden con cierto rencor de él) y toda la historia de evolución que han experimentado desde sus orígenes, para así poder quizás, buscar el truco final que haga que este tipo de técnicas salgan a la primera. Por lo tanto, pongámonos al asunto sin más dilación. Empezamos, no?Las técnicas de “blotting“, transferencia o hibridación, consisten básicamente en la transferencia de ADN, ARN y proteínas de una muestra determinada que se quiere estudiar, .a una membrana para luego ser hibridadas con una sonda y así permitir su separación, identificación y posterior cuantificación. Se trata pues de técnicas analíticas que tienen como nexo común primario, una electroforesis capilar o una electroforesis en gel (puedes leer más sobre el origen de esta técnica aquí) generalmente en geles de agarosa (monodimensional) para los ácidos nucleicos y en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)  (mono y bidimensional) para las proteínas y de forma secundaria, con la hibridación de un sonda complementaria en el caso de ácidos nucleicos o de anticuerpos, para el caso de las proteínas. En ambos casos, se terminan visualizando por medios colorimétricos (densitometría, espectrometría), por quimioluminiscencia (con luminol como el que se usa para detectar sangre en el lugar de delito, muy CSI todo), por fluorímetria (películas sensibles a la luz, cámaras CCD/CMOS, etc) o autorradiografía (películas de rayos X). Uno de los principales avances que se realizaron sobre estas técnicas de blotting, fue el desarrollo de la técnica del electroblotting, patentada en 1989 por William J. Littlehales, se transfiere a una membrana de nailonnitrocelulosaPVDF (fluoruro de polivinilideno) para así permitir su unión posterior a las sondas o anticuerpos que permiten detectar las moléculas a estudiar y posteriormente, cuantificarlas. Generalmente el dispositivo del electroblotting, sigue la siguiente estructura de ánodo (polo negativo) a cátodo (polo positivo): esponja – hojas de papel filtro empapadas en buffer – gel de electroforesis – membrana de nailon/nitrocelulosa/PVDF (habitualmente, se emplea la membrana de nylon y nitrocelulosa para realizar la transferencia de ácidos nucleicos (ARN y ADN respectivamente) y el PVDF para la transferencia de proteínas, aunque pueden ser válidas ambas indistintamente)  – hojas de papel filtro empapadas en buffer – esponja. Cómo la muestra correrá según la corriente y ésta siempre lo hace de ánodo a cátodo, la membrana siempre tiene que disponerse en dirección al cátodo. Con esta técnica se mejoraba el procedimiento de transferencia, más manual y más delicado, de la transferencia por difusión y transferencia al vacío.La primera de las técnicas de blotting en aparecer fue la Souther-blot, desarrollada por el biólogo molecular inglés, sir Edwin Mellor Southern. Sí, has leído bien, la técnica lleva su apellido. La técnica apareció como resultado de los trabajos realizados por Southern como profesor en la universidad de Edinburgh en Escocia, sobre la estructura del ADN en 1973. Realmente fue un acierto por parte de Southern, pues su técnica no es más que la ingeniosa síntesis de tecnologías y descubrimientos biológicos anteriores: el descubrimiento de las enzimas de restricción por parte de Kelly, Smith, Nathans y Arber, cómo la electroforesis en gel permite separar los fragmentos por Danna y Nathans en 1971 y los intentos por parte de Frederick Sanger por transferir fragmentos de ADN a membranas de dietilaminoetil celulosa (DEAE-C). Pero no fue hasta en 1975, después de algunas “rejections” por falta de resultados originales e interesantes (curioso no?) y lo que hoy podriamos llamar una estrategia pionera del creative commons o la tan reclamada “open science“(pasó a un científico conocido un esquema del protocolo de la técnica, exigiendo únicamente los créditos como autor original), cuando se publicaba en el Journal of Molecular Biology el artículo “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by Gel Electrophoresis” y con ello, daba comienzo a una nueva era en el análisis de los ácidos nucleicos que fue rápidamente aprovechada por toda la comunidad científica. Esta técnica permite detectar la presencia de una secuencia de ADN 

concreta (esto es: mapeo genético, descubrimiento de genes, etc), en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Por estar razón, la Southern Blot fue la prueba originaria de determinación de parentesco o identificación de individuos, conocida como fingerprints o huella genética, que tanta revolución causó en la medicina forense diez años después del desarrollo de la Souther-blot. Hoy en día, muchos de los chips que permiten el genotipado de muestras (ej: los microarrays de Affymetrix) utilizan el mecanismo empleado en el desarrollo de la técnica Souther-Blot, siendo muy útiles para el diagnóstico de ciertas enfermedades genéticas de baja prevalencia tales como el síndrome de X-frágil, el síndrome de Angelman o el síndrome de Prader-Willi. Gracias a todo ello, Edwin Southern obtuvo reconocimientos y premios acordes a la importancia y desarollo de su técnica. Entre ellos, destaca el prestigioso premio Lasker Award for Clinical Medical Research recibido en 2005, conjuntamente con el desarrollador de la técnica de fingerprints, Alec John Jeffreys, por el desarrollo de las dos técnicas más poderosas que han revolucionado la genética humana y la genética forense (os dejo el enlace a una entrevista suya con motivo del premio, donde explica un poco cómo llegó a conseguir sus logros como científico). Dos años antes, Edwin Southern era nombrado “Caballero de la gran cruz de la Orden del Imperio Británico” y en 1998, fue condecorado con la medalla real de la Real Society de Londres. Hoy en día es profesor emérito de bioquímica en la universidad de Oxford, miembro del Trinity College y es fundador de dos empresas, la biotecnológica Oxford Gene Technology (que incluso tuvo pleitos por derechos de patente con Affymetrix, en las referencias tenéis un artículo muy interesante sobre este tema y otros relacionados con la política científica) y la organización sin ánimo de lucro, Edina Trust.

Cómo toda técnica con potencial, pronto aparecieron las primeras adaptaciones y mejoras. La primera de ellas fue la propuesta por James Alwine, Dave Kemp, and George Stark del departamento de bioquímica de la Universidad de Standford, quienes viendo que la técnica de Southern estaba bien caracterizada para moléculas de ADN, probaron a buscar alternativas para la otra molécula que rige nuestra genética, el ARN. Por tratarse de la molécula contraria al ADN y siguiendo el juego de palabras con los puntos cardinales, decidieron nombrar esta técnica como Northern blot. En 1977, publicaron en PNAS el artículo “Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes” que ponía de manifiesto el protocolo a seguir para detectar moléculas de ARN e una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (ej. expresión de genes buscando ARNm de un péptido específico en una mezcla de ARNs, splicing del ARN, regulación génica, etc). La principal diferencia con la técnica de Southern blot, radica en los reactivos y algunas técnicas previas que se pueden utilizar en el procedimiento: pretratamiento con formaldehído para evitar la formación de estructuras secundarias internas en la molécula de ARN, aislamiento de ARNm con colas poli-adeninas mediante cromatografía, empleo de geles con poliacrilamida y urea para separar los ARNm, uso preferente de transferencia por capilaridad o vacío debido a la mayor fragilidad de la molécula de ARN, preferencia del empleo de membranas de celulosa tratada químicamente (papel DBM) o  nailon y buffers de transferencia con formamida o el uso de sondas de ADN y ARN indistintamente para la hibridación. Usado en diagnóstico y caracterización de ciertas líneas celulares, presenta desventajas (menos sensible que una RT-PCR, menos fiable si se emplean oligosondas, muy poco específicos ante contaminaciones muy leves con ARN-asas, etc) pero también ciertas ventajas (detecta pequeños cambios de expresión en los genes). Una forma poco utilizada del northern blot, es el Northern blot inverso o reverso, donde se detectan moléculas de ADN aisladas, fijadas a una matriz (similar a los microarrays) mediante el empleo de sondas de ARN.  

Y del mismo equipo de Stark, surgió el germen que dió lugar a  la siguiente técnica análitica de hibridación y/o transferencia. Siguiendo con el juego de palabras de los puntos cardinales, a esta técnica la denominaron como Western blot o inmunoblotting. Nombrada así por uno de los post-docs del grupo de Nowinski englobado en el Hutchinson Cancer Center de Seattle, W. Neal Burnette, debido a la ubicación del laboratorio en la costa oeste (aunque miembros del equipo de G. Stark también se lo atribuyen, aunque nunca lo describireran en los artículos), fue desarrollada a medias y con una competencia feroz,  entre el grupo de G. Stark, el grupo de Brunette y el grupo de Julian Gordon, donde estaba como post-doc Harry Towbin, en el Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research de Suiza. Observaron que siguiendo las técnicas de hibridación descritas, surgían problemas para detectar las proteínas. Sin embargo, empleando anticuerpos específicos contra esas proteínas, la cosa cambiaba. Y eso andaban estudiando Burnette y Towbin, para estudiar los etitopos de los antígenos de las estructuras de proteínas de retrovirus y estudios de función-estructura de complejos ribosomales, respectivamente, sin saber lo que estaba haciendo el otro. El ganador de la carrera fue el equipo de George Stark, Jaime Renart y Jakob Reiser quienes consiguieron ver publicado el artículo “Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure” en PNAS, en julio de 1979. Le siguieron Towbin, encabezado por Gordon, quienes vieron publicado el artículo “Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications” en septiembre de 1979. La diferencia entre el trabajo presentado por Stark y el presentado por Towbin, radicaba en el uso de electroblotting por parte de este última a diferencia de la transferencia por difusión empleada por Stark. Por su parte, Brunette quien sufrió varios “rejected” durante su camino por publicar su procedimiento de Western blotting, pero fue ampliamente difundido como preprint por parte de los investigadores en biología molecular, vio publicado el artículo “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A” en la revista Analytical Biochemistry, en abril de 1981. Aunque llegara dos años más tarde, Brunette defendía su técnica por ser más simple su procedimiento de detección y visualización y su universalidad. Las diferencias principales con las otras técnicas de hibridación, radican el tipo de electroforesis (únicamente en geles SDS-PAGE), la alternativa que supone el uso de membranas con PVDF y la detección mediante el uso de anticuerpos primarios (contra las proteínas de interés) y anticuerpos secundarios (se une al complejo de anticuerpo primario – proteína de interés). Su uso principal es para detectar proteínas específicas en una muestra homogenizada de tejido o extracto, pero también para el diagnóstico de la enfermedad infecciosas como la enfermedad de Lyme, la confirmación del test del virus VIH, del virus de la hepatitis B o del diagnóstico de encefalopatía espongiforme bovina (priones).

Otras denominaciones derivadas de la técnica origen, la Southern blot, son la técnica Eastern Blot que se usa para analizar modificaciones post-traduccionales de proteínas (ej: epitopos de carbono en glicosilaciones, metilaciones, fosforilaciones etc), Far-eastern blot, para el análisis de lípidos, Northwestern blot para detectar interacciones de ARN – proteínas o Southwestern blot para identificar uniones ADN – proteínas. A veces, se combinan con otras técnicas analíticas, como la Western blot y la espectroscopía de masas para una mejor cuantificación de proteínas.

Antes de terminar la entrada, os dejo este vídeo de divulgación científica sobre la técnica de Northern blot, porque se puede ver bien la transferencia y porque lo presenta una científica, para que luego digan que los que más divulgan son hombres.

¿A que te has sorprendido saber que detrás de unas técnicas tan rutinarias, hubiera tanta historia y curiosidades? Pues eso es precisamente, lo que más me fascina de este tipo de entradas, descubrir la historia detrás de las técnicas de laboratorio más habituales. Espero que hayáis aprendido algo nuevo y que os pique la curiosidad por seguir ahondando en la historia de la ciencia.

Esta entrada participa en la LXIX edición del Carnaval de Química, alojada en el blog Destilando Ciencia de @adancoal .

¡Nos “leemos” en la próxima entrada!                                                                                TatianaDC

Fuentes:  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5424904/pdf/40504_2006_Article_30.pdf http://www.genhunter.com/western-blot-inventor/ http://es.scribd.com/doc/48656719/History-of-Northern-blotting http://www.aaas.org/blog/scientia/southern-northern-western-and-eastern-blots http://www.asbmb.org/asbmbtoday/asbmbtoday_article.aspx?id=16084 http://www.bioprocessintl.com/wp-content/uploads/bpi-content/BPI_A_141202AR02_O_231360a.pdf http://www.sciencemag.org/sites/default/files/custom-publishing/documents/Western_Blotting_ScienceGE2booklet_MedRes_9june15.pdf http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(05)67775-6/fulltext http://www.tandfonline.com/doi/pdf/10.1080/15548627.2016.1255382 http://www.slideshare.net/Chepkitwai/blotting-techniques-61293002 http://www.afrivip.org/sites/default/files/molecular_hybridization_complete_0.pdf https://blog.addgene.org/evolution-of-lab-techniques                http://biologywise.com/northern-blot-vs-southern-blot-technique http://bitesizebio.com/639/southern-northern-western-and-eastern/                    http://www.the-scientist.com/tools-and-technology/blotting-technologys-permanence-is-assured-as-its-applications-in-the-laboratory-flourish-58749                  http://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot http://es.wikipedia.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_(biolog%C3%ADa_molecular)

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