Kary Mullis, el padre de la PCR; las siglas que revolucionaron los laboratorios de investigación.

Hacía bastante tiempo que no le dedicaba una entrada a uno de los nombres ilustres que la historia de la ciencia ha dejado en el memoria de muchos investigadores y laboratorios. En esta ocasión, me he decantado por dedicarle la entrada a uno de los nombres que más odios y amores despierta entre todos los que nos dedicamos a la ciencia de poyata. Estoy hablando de Kary Mullis, padre de la técnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction), las siglas de la técnica más usada y que más revolución causó en los laboratorios de todo el mundo desde la década de los años 80. Además de los sinsabores que se puden sufrir al realizar una PCR (el ADN no siempre amplifica como un@ quiere), en sí mismo el personaje de Kary Mullis y sus declaraciones públicas, también suelen generar un cierto desconcierto entre la comunidad científica. Si quieres saber el motivo y cómo llegó a inventar una de las técnicas que más ha ayudado al progreso de la biología molecular, ya sabes… Sigue leyendo! Kary Bank Mullis (28 de diciembre de 1944, Lenoir, Carolina del Norte (EE.UU)), se crió en el entorno de la granja de sus abuelos maternos, aprendiendo conocimientos sobre los animales y quehaceres del campo. A destacar la entrañable relación que mantenía con su abuelo materno, James Albert Barker conocido cariñosamente como “Pop”  (de cuyo padre, Kary lleva en su honor, su nombre) y de su bisabuela materna, “Nanny” que guardaba Kary de esa época (para leer más, aquí). Pasado los cinco años, su padre Cecil Banks Mullis y su madre, Bernice Alberta Barker, se mudaron a Columbia, Carolina del Sur, donde Kary abandonaría su interés por la naturaleza y empezaría su coqueteo con la química (a destacar el inicio de sus experimentaciones con compuestos explosivos tras el regalo en las navidades de su noveno cumpleaños de un set de química (como el Quimicefa, vamos)). Motivados o no por la separación de sus padres, estos años mostrarían los primeros indicios del carácter rebelde y transgresor que tanto caracterizarían el perfil científico de Kary. A los 22 años,Mullis obtiene su licenciatura en Química en el Instituto de Tecnología de Georgia, donde conoce a su primera mujer, Richards, con quien tiene a su primera hija Louise. Es en el Georgia Tech, donde aprende las principales técnicas y conocimientos sobre química, pero también sobre  física y  matemáticas que luego usaría y le serviría para desarrollar los principales logros de su carrera profesional. Coetáneamente comienza a desarrollar su perfil empresarial, a través del trabajo temporal en una compañía química local. Terminada su licenciatura, obtuvo una beca para estudiar el doctorado en bioquímica aunque, su idea inicial era hacerlo en astrofísica, hecho que se manifiesta por la publicación en la revista Nature, de una comunicación científica titulada “Cosmological significance of Time Reversal“. Aún y a pesar de todo, es reclutado para trabajar con el bioquímico John Brian Neilands en la Universidad de California, Berkeley, quien en esos momentos estaba trabajando en el transporte microbiano de hierro. En 1973, Kary Mullis obtiene su título de doctor en bioquímica por su tesis basada en la síntesis y caracterización estructural de las moléculas transportadoras de hierro en las bacterias.

Finalizado su doctorado, Mullis sufriría una crisis de identidad profesional pues parece ser que intentó dejar la ciencia dos veces; la primera cuando intentó ser escritor de ficción narrativa y posteriormente, cuando su perfil empresarial lo llevó a montar una panadería. Tras lo que parece un período de gran reflexión interior, Mullis recapacitó e inició una estancia post-doc en la unidad de cardiología pedíatrica de la Escuela de Medicina de Kansas, dentro del grupo de Richard Zakheim y Leone Mattioli, siendo su primera incursión en la bioquímica humana. Además de devolver de nuevo al mundo académico, esta nueva incursión profesional supuso un cambio en su vida personal pues, la directora de la escuela de Medicina de Kansas sería la segunda esposa de Kary, Cynthia, madre de sus hijos Christopher y Jeremy. Durante esta etapa, Mullis trabajó sobre el papel de la angiotensina en la fisiología vascular pulmonar, trabajo que culminó en la publicación de algunos artículos científicos en revistas de cierto impacto, en los cuáles Kary no figuraba como primer autor. Concluído su trabajo en Kansas y cesada su convivencia matrimonial con Cynthia, Kary regresa a California donde gracias al apoyo e impulso de su amigo Thomas White, jefe de investigación y desarrollo de Cetus Corporation y posteriormente de la sucursal Roche Molecular Systems (empresa que después iniciaría el camino a la secuenciación masiva en paralelo), en 1981 empieza otra estancia post-doctoral en la universidad de California en San Francisco, donde se especializará en química farmacéutica junto con el grupo de investigación de Wolfang Sadee. De ahí, y de nuevo gracias a Thomas White, Mullis llegaría a ser contratado por la empresa biotecnológica Cetus Corporation en 1979, con sede en Berkeley (California), para el desarrollo de oligonucleótidos (secuencias cortas de ADN o ARN, con cincuenta pares de bases o menos, usadas hasta entonces como sondas para hibridar con genes clonados, como bloqueantes de ARN mensajero o como cebadores para la secuenciación de ADN o ADN complementarios (a partir de ARN)) para los diferentes proyectos y investigaciones que estaba llevando a cabo la compañía. 

Por aquel entonces, la empresa Bioresearch liderada por el Dr. Cook, estaba mejorando la producción de oligonucleótidos, con lo cuál aumentaba la competencia directa sobre el grupo de trabajo de Mullis en Cetus. Este fue sin duda el pistoletazo de salida para que Kary se pusiera manos a la obra con la búsqueda de la forma de producir oligonucleótidos para secuenciar mutaciones causantes de ciertas enfermedades (la primera, las anemias depranotíticas o de células falciformes) sin depender de la clonación del fragmento en cuestión. El momento “eureka” le llegó a Kary Mullis una noche, cuando conducía su Honda Civic por la autopista 128, junto a la que sería su tercera esposa, Jennifer Barnett, hacia su refugio en el Condado de Mendocino (California). Observando como los coches discurrían por la autopista de un lado a otro, a Mullis se le ocurrió la idea de utilizar ciclos térmicos repetitivos que permitieran la separación de las dos cadenas del ADN y adiccionar dos cebadores u oligonucleótidos complementarios al molde de DNA, que por medio de una operación matemática exponencial, permitirían amplificando dicho molde hasta 100 billones de veces. En palabras de Kary Mullis el momento fue tal que así:

Emocionado, comencé a calcular potencias de dos en mi cabeza: dos, cuatro, ocho, 16, 32. Recordé vagamente que dos elevado a diez era aproximadamente mil y que, por tanto, dos a la veinte era alrededor de un millón. Detuve el coche en un desvío sobre el valle de Anderson. Saqué lápiz y papel de la guantera; necesitaba comprobar mis cálculos. Jennifer, mi soñolienta pasajera, protestó aturdida por la parada y la luz, pero exclamé que había descubierto algo fantástico. {…} Mi mente regresó al laboratorio. Las cadenas de DNA se enrrollaron y flotaron. Espeluznantes imágenes azules y rosas de moléculas eléctricas se inyectaron en algún lugar entre la carretera y mis ojos. {…} No dormí esa noche. A la mañana siguiente compré 2 botellas de Pinot Nou {…} Había diagramas de reacciones de PCR por todas partes. 

El único problema de partida que le surgió a Mullis fue el de que  en cada ciclo había 
que añadir la enzima ADN polimerasa, ya que esta se inactivaba con las temperaturas tan altas necesarias para desnaturalizar el ADN y exponer las bases nitrogenadas de sus nucleótidos, que provocaba que hubiera que  hacerlo manualmente en tres baños mantenidos a las diferentes temperaturas, pasando rápidamente la muestra de un baño al otro, repitiendo esto varias decenas de veces. El problema se lo resolvieron dos compañeros de la compañía Cetus, Susanne Stoffel, David H. Gelfand y Randall K. Saiki quienes fueron capaces de aislar y purificar la la Taq polimerasa, un tipo de DNA polimerasa termoestable denominada así por su bacteria de origen, la Thermus aquaticus. Así con un mix de reacción compuesto por el ADN a amplificar, una solución tampón (con cloruro de magnesio), los nucleótidos necesarios para amplificar, los cebadores, primers u oligonucleótidos y fundamentalmente, la Taq polimerasa, que junto con la aplicación de ciclos térmicos repetitivos, provocaban que se repitieran las aplicaciones de las DNA polimerasas conduciendo a una reacción en cadena de replicación continua para un segmento específico del genoma, la conocida como PCR o reacción en cadena de la polimerasa.

Tras varias pruebas con resultados desalentadores, finalmente el 16 de diciembre de 1984, Kary Mullis y su equipo, donde es necesario hacer mención a Fred Faloone, lograban probar lo que sería la técnica más revolucionaria de la biología molecular de finales de siglo: consiguieron visualizar los productos de amplificación mediante la técnica de Southern Blot, quedando así probada la realización de la amplificación del DNA por medio de la técnica de PCR. Esto dio paso a que se probara la técnica sobre la amplificación de un gen concreto, el de la betaglobina, realizado de nuevo por dos compañeros de trabajo de Kary Mullis, Randall Saiki y Henry Erlich. Sin embargo, este descubrimiento como otros grandes descubrimientos no estuvo exento de polémicas a su alrededor; por un lado, los altercados surgidos en cuanto a la autoría en exclusiva de Mullis de la técnica entre los compañeros de Cetus Corporation, por otro, el hecho de que la revista Nature hubiera rechazado inicialmente la publicación del artículo donde Mullis demostraba la eficacia de la PCR por su similitud con el trabajo presentado 17 años antes por Gobind Khorana y Kjell Klepp, quienes describían una técnica similar a la PCR pero cuya diferencia radicaba en la aplicación de un sólo cebador o primer por cada molde de DNA. Finalmente, la patente de la PCR fue aprobada el 28 de julio de 1987. Aunque posteriormente fue vendida por 300 millones de dólares a Roche Molecular System, Kary Mullis sólo recibió como bonificación en concepto de autoría del invento por parte de Cetus que ascendió a 100.000 dólares. De nuevo y al igual que en algunas de la técnicas de mayor impacto en la actualidad, la técnica de la PCR también fue objeto de conflictos legales acerca de su patente, pues la empresa Dupont reclamó la autoría de la patente de la PCR alegando que sus trabajadores ya habían realizado avances al respecto en 1969. 

Una vez normalizada la técnica, el siguiente paso fue comercializar el aparato físico que permitiera llevarlo a cabo. El primer intento es el conocido como Mr. Cycle, un prototipo de termociclador muy rudimientario y de díficil manejo, pues se utilizaba sobre todo cuando aún era necesario añadir las enzimas “frescas” antes de cada cambio del ciclo térmico. Sería a finales de 1987 cuando, como resultado de un convenio firmado entre Cetus Corporation y la multinacional Perkin-Elmer, se comenzaron a fabricar los primeros termocicladores, más pareceidos a  los que conocemos actualmente. 

A partir de esto, comenzó el despegue fulgurante de la PCR, que tanto ayudó para el desarrollo y mejora de la biología molecular, la biotecnología, la medicina forense, la genética e incluso la paleobiología (sí, se pensaron crear algo parecido a Jurassic Park) 

Pasado el subidón del descubrimiento de la técnica del PCR, Kary Mullis decidió abandonar en 1986 su trabajo en Cetus Corporation y entró a formar parte de la compañía  Xytronyx de San Diego (Califonia) donde trabajó sobre fotoquímica y tecnología del DNA. En 1987, pasó a trabajar como consultor y asesor científico de numerosas compañías como Angenics, Cytometrics, Eastman Kodak, Abbott Labs, Milligen/Biosearch y Specialty Laboratories. Años más tarde, mientras estaba surfeando en California, recibió la llamada que todo científico ansía toda su vida; el comité sueco que otorga los premios Nobel lo había premiado con el premio Nobel de Química de 1993, por sus contribuciones en el desarrollo de métodos químicos basados en el ADN […] por su invención del método de la reacción en cadena de la polimerasa. El premio fue compartido con el bioquímico canadiense Michael Smith, por sus fundamentales contribuciones en el establecimiento de mutagénisis directas basadas en oligonucleótidos y por su desarrollo de los estudios de las proteínas. Otros premios que ha ganado son: el premio Japón (1993), el premio Thomas A. Edison (1993); el premio al científico del año de California (1992); el premio nacional de Biotecnología (1991); el premio Gairdner, Toronto, Canada (1991); el premio “R&D Scientist of the Year” (1991); el premio William Allan Memorial de la Sociedad Americana de Genética Humana (1990); el premio Preis Biochemische Analytik de la Sociedad Alemana de Bioquímica clínica y Boehringer Mannheim (1990). Kary Mullis fue nombrado doctor honoris causa de la Universidad del Sur de California en 1994 y posee desde 1998 una placa en el paseo de la fama de los inventores. Hoy en día, vive con su tercera esposa Nancy Cosgrove en Newport Beach, California. 

Además de su carácter egocéntrico, de su forma de actuar por libre sin importarle los convencionalismos, Kary Mullis ha pasado a la historia como uno de los premios Nobel con el mayor número de excentricidades declaradas públicamente. Desde declarar que su vocación es resultado de una alineación de Mercurio y Marte en la constelación de Sagitario, pasando por la declaración de haber sido rescatado por una persona que viabaja en un plano astral, que recibió la visita de un mapache alienígena hasta su idea de vender medallas o tarjetas con muestras de DNA de personajes famosos. Sea o no causa de su confesión acerca del consumo durante su época estudiantil de dietilamida de ácido lisérgico, conocida como LSD o ácido, Kary Mullis será recordado también por haber renegado públicamente de que el virus VIH sea la causa de la aparición del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), perteneciendo a la corriente de pensamiento impulsada por el alemán Peter Duesberg, hecho paradójico pues la técnica de la que es padre, sirvió para cuantificar el virus cuando la epidemia de SIDA entró en EE.UU. Otra postura destacable es su definición como negacionista del cambio climático y de la destrucción del agujero de la capa de ozono, acusando a organizaciones, gobiernos y científicos de estar detrás de las campañas de concienciación y sensibilización. Incluso, y esto es más que sorprendente, también ha sembrado dudas sobre la propia técnica que tanto le ha dado profesionalmente. Sin embargo, la lista no se acaba, pues también son destacables sus “sacadas de tiesto” realizadas tras obtener el premio Nobel; desde ser amonestado por dar un mal uso de un puntero láser en Suecia durante su estancia para recibir el premio, a su falta de protocolo al recibir el premio Japón, pasando por sus excesos con el consumo de alcohol y el trato con las congéneres femeninas. Ya para finalizar y a modo de resumen de la excentricidad de este premio Nobel, destacar la petición de la realización de un mural en el que se puede observar una ballena que choca contra la oficina de Francis Crick, al artista John Worley, que figuraba en una de las murallas de Cetus Corporation.

Y para teminar, aquí os dejo un vídeo donde habla el propio Kary Mullis sobre como surgió la idea del PCR. 

Hay muchos más que reflejan muchas de las cosas que he tratado de resumir en esta entrada, así que os animo a que si tenéis tiempo y ganas, vayáis conociendo más de cerca a tremendo personaje de la historia de la ciencia. Espero que os haya gustado y que, como siempre, hayáis aprendido algo más sobre la ciencia, su historia y los pormenores de sus avances. 

¡Nos “leemos” en la próxima entrada!                                                                                 TatianaDC

Fuentes:                                                                                                              Thompson, G. “Nobel Prizes that Changed Medicine”  Imperial College Press (2012) https://www.karymullis.com/biography.shtml                    http://www.uky.edu/~holler/mullis.html  http://americanhistory.si.edu/blog/2013/01/happy-birthday-kary-mullis-a-non-stereotypical-scientist.html http://www.sciencemag.org/sites/default/files/custom-publishing/documents/PCR.pdfhttp://americanhistory.si.edu/collections/search/object/nmah_1000862 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullis-bio.html  https://cs.brown.edu/courses/csci1810/resources/pcr%20origin.pdf http://blogs.20minutos.es/ciencias-mixtas/tag/kary-mullis/    https://www.muyinteresante.es/ciencia/articulo/kary-mullis http://microbiosbinarios.blogspot.com.es/2013/12/del-cuaderno-de-un-biologo.html http://apuntesbiotecnologiageneral.blogspot.com.es/2015/02/como-llego-kary-mullis-la-idea-del-pcr.html                                                  http://elinstigador.wordpress.com/2014/05/25/kary-mullis-premio-nobel-de-quimica-y-el-fraude-del-sida/                                                                http://en.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullis http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_polymerase_chain_reaction  http://www.nytimes.com/1998/09/15/science/scientist-at-work-kary-mullis-after-the-eureka-a-nobelist-drops-out.html                                                http://www.mediatheque.lindau-nobel.org/laureates/mullis  http://www.huffingtonpost.com/lorie-karnath/amplifying-evolution-scie_b_8582114.html

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