Química a lo DJ: la cromatografía, la técnica analítica más remasterizada.

Han pasado varios meses desde la última entrada dedicada al repaso histórico de las principales técnicas y tecnologías que se emplean en los laboratorios, así que era de recibo escribir una entrada sobre ello. En este caso me he decantado por una de las técnicas analíticas que más variantes o subtipos tiene (de ahí el título de la entrada, como las canciones más populares donde los DJs hacen remixes de los remixes) y que además, su origen tiene más proximidad con el ámbito biológico que con el químico (ahí reivindicando la profesión). Hablo, claro está, de la cromatografía. Si quieres saber un poco más sobre la historia y particularidades de esta técnica cromatográfica, ya sabes… Sigue leyendo! 

La cromatografía (del griego ‘chroma‘ (color) y ‘grapho’ (escritura)), comprende un conjunto de técnicas que tienen como finalidad la separación de mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de cada componente sobre/en otras sustancias en estado sólido o líquido. Esto es, consiste en pasar un mezcla de sustancias o fase móvil, sobre una fase estacionaria que retrasará el flujo de las sustancias de la mezcla haciendo que al desplazarse sobre ella la mezcla, a diferentes velocidades (según las diferentes interacciones producidas entre los solutos de la fase móvil a medida que se desplazan alrededor o sobre la fase sólida estacionaria), se separen los diferentes componentes de la mezcla. Aunque se datan los primeros experimentos relacionados con la cromatografía en 1850, por el pintor alemán Philipp Otto Runge quien observó que al depositar gotas de sustancias colorantes sobre papel secante, se originaban zonas coloreadas diferenciadas, no sería hasta 1906 cuando el botánico ruso, Mijaíl Semiónovich Tsvet acuñaría el término de “cromatografía” a través de sus experimentos iniciales de separación de clorofilas de tejidos vegetales (fase móvil) en columnas de carbonato de calcio (fase estacionaria) y de separación de los lípidos de la yema de huevo en una columna de inulina. Se trataba así de la primera cromatografía de adsorción en columna. Parece ser que sus estudios fueron inicialmente ignorados por la comunidad científica debido en parte, a que dichos estudios estaban escritos en ruso y publicados en revistas de menor impacto (en otros casos, era por la corriente escéptica que imperaba entre los químicos y botánicos coetáneos de Tsvet). No sería hasta 1931, cuando el químico alemán Richard Kuhn, y premio Nobel de Química de 1938 por su trabajo sobre los carotenoides y vitaminas, junto con el bioquímico austríaco Edgar Lederer y el asistente de laboratorio de Kuhn, Alfred Winterstein, emplearon la cromatografía para estudiar los carotenoides presentes en diversos vegetales. Paralelamente, Paul Karrer, en Zurich (Suiza) y  László Zechmeister, en Hungría también estaban desarrollando avances en la técnica cromatográfica para el estudio de los pigmentos vegetales. Según algunos artículos, fue una contienda científica donde primó la gentileza y caballerosidad entre los diversos científicos.

Del trabajo de estos pioneros de la cromatografía, surgiría el segundo premio Nobel de Química relacionado con la cromatografía; el ganado por los bioquímicos ingleses Richard L. M. Synge y Archer John Porter Martin, en 1952, quienes redujeron las limitaciones de la cromatografía en columna desarrollada por Kuhn, Lederer y Winterstein, diseñando la cromatografía de partición donde la fase estacionaria pasaba de ser sólida a ser líquida (se facilitaba la separación de compuestos hidrofílicos, a diferencia de la cromatografía en columna donde los compuestos que se separaban eran principalmente hidrofóbicos). Aunque tanto Synge como Martin ganaron el nobel de química, es necesario mencionar el papel llevado a cabo por R. Consden y A. H. Gordon en el desarrollo de esta nueva versión de la cromatografía, la cromatografía en papel, y de las futuras como la cromatografía en capa fina (thin layer chromatography, TLC), desarrollada en 1956 por el farmacéutico alemán Egon Stahl . La primera en 1947, cuando la Comisión de Energía Atómica de EE. UU. dio a conocer información sobre el uso de la cromatografía de intercambio iónico para la separación de productos de fisión nuclear, desarrollada por Boyd, Tompkins, Spedding, Rieman, y otros autores. En 1952, el químico inglés Anthony Trafford James y Archer John Porter Martin, diseñaron la cromatografía de gases. Más o menos en la misma época, Roland Gohlke y Fred McLafferty comenzaron a usar lespectrometría de masas como método auxiliar a la cromatografía de gases para facilitar la identificación de los diferentes elementos químicos que forman un compuesto o mezcla de compuestos. Entre 1956 a 1964, Jerker Porath y Per Flodin desarrollaron paralelamente  junto con Grant Henry Lathe y Colin R. Ruthven y el que finalmente perfeccionó el método, J. C. Moore, la cromatografía de exclusión o filtración en gelA mediados de la década de los 70, de las hipótesis de Cal Giddings y Josef Huber, comenzarían a desarrollarse los primeros instrumentos destinados a realizar la cromatografía líquida de alta resolución (High Performance Liquid Chromatography o HPLC). Hoy en día, esta técnica está fuertemente asociada a la presencia de un espectrómetro de masas, que presenta un origen físico pues fue primordialmente desarrollada por J.J Thompson. Os comparto un vídeo donde hacen un pequeño repaso histórico sobre esta relación de simbiosis entre la cromatografía y espectrometría de masas. 

-NOTA AL LECTOR- La espectrometría de masas, es una técnica cuantitativa y cualitativa que, aunque lleve el prefijo “espectro” nada tiene que ver con las técnicas espectrométricas (hablé de una de ellas aquí) pues no utiliza radiación en su medición y sí modifica la muestra químicamente. Para más detalles sobre la espectrometría de masas, os recomiendo leer este enlace, este otro enlace o aquel otro.

En función de la separación producida durante el movimiento de arrastre de la mezcla sobre la fase estacionaria, se observan diferentes tipos de cromatografía:                    a) Cromatografía de adsorción: los componentes de la mezcla se “unen” o adsorben a la superficie de la fase estacionaria. Se utiliza para separar compuestos de polaridad baja o media.  b) Cromatografía de reparto: la separación o migración de los componentes de la mezcla, dependerá del coeficiente de reparto o partición (K: cociente entre la concentración de los compuestos en los diferentes eluyentes o disolventes de la fase móvil) de los compuestos entre la dos fases móvil y estacionaria, que indica el carácter hidrófilo o hidrófobo de una sustancia, es decir su mayor o menor tendencia a disolverse en disolventes polares (ej. agua) o en disolventes apolares (ej. disolventes orgánicos). Puede ser de fase normal (cuando la fase móvil es baja polaridad y la fase estacionaria muy polar) en donde los primeros compuestos en detectarse son los menos polares, o de fase inversa (si la fase móvil es de elevada polaridad y la fase estacionaria muy poco polar) dónde los primeros compuestos en detectarse son los más polares.            c) Cromatografía de exclusión, permeación en gel o de tamizado molecular: los compuestos se separan en función de su tamaño, según las cavidades presentes en las fases estacionarias (granos huecos esféricos, de diámetro controlado y atravesados por numerosos poros de diámetro homogéneo). Las moléculas más grandes se eluyen como las primeras y luego se van eluyendo las restantes, en función del tamaño de mayor a menor. Conocer el límite de exclusión de la fase estacionaria es importante puesto que es el valor de peso molecular a partir del cual los compuestos no pueden ser separados en la columna, al ser más grandes que los poros de las cavidades de la fase estacionaria. d) Cromatografía de intercambio iónico: se basa en la interacción entre diferentes cargas atómicas; esto es, la fase estacionaria posee carga eléctrica y por ello interacciona con los componentes de la muestra que tienen carga opuesta. Existen dos tipos: intercambio iónico aniónico (fase estacionaria con carga positiva que retiene compuestos con carga negativa) e intercambio iónico catiónico (fase estacionaria con carga negativa que retiene compuestos con carga positiva). Se utiliza para separar compuestos cargados, incluyendo aminoácidos, péptidos y proteína. e) Cromatografía de afinidad: la separación se basa en la especificidad biológica singular, no covalente, producida entre un componente de la muestra y otra molécula unida a la fase estacionaria; esto es, se utiliza la interacción específica entre enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo o ligando-receptor.

La siguiente clasificación tiene que ver con la disposición y estado de la fase estacionaria:                                                                                                                       1. Fase estacionaria plana.                                                                                                 1.1. Cromatografía en papelAunque hoy en día está casi en desuso, es útil para separar mezclas complejas de compuestos similares, al comparar con otros de mezclas conocidas. Es una técnica puramente cualitativa, sólo sirve para identificar los componentes de la muestra .           1.2 Cromatografía en capa fina (TLC)

En el caso de la cromatografía de capa fina, el valor del factor de retención (RF) o distancia de desplazamiento sobre la placa de cada compuesto desde el punto de aplicación, sirve para la identificación y separación del compuesto a estudiar.

2. Fase estacionaria en columna vertical.                                                                           2.1 Fase estacionaria líquida (LC).                                                                                   Además de las cromatografías líquidas de absorción, reparto, exclusión, permeación en gel o de tamizado molecular, intercambio iónico y/o afinidad, aquí también se encuentra la cromatografía líquida de alta presión o de alta eficacia, también conocida como HPLC. En la HPLC, la mezcla es forzada a pasar a través de una columna (fase estacionaria) por un líquido (fase móvil) a elevada presión, lo que disminuye el tiempo que los componentes separados permanecen en la fase estacionaria, y por lo tanto, el tiempo de difusión dentro la columna, mejorando la resolución de la cromatografía. El valor del tiempo de retención (t) se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. Esto permite que esta técnica sea capaz de separar y cuantificar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Para una mayor  selectividad y sensibilidad en la identificación de los componentes de la mezcla, se suele utilizar la cromatografía líquida asociada con la espectrometría de masas (LC-MS).  

2.2 Fase estacionaria gaseosa.                                                                                         2.2.1 Cromatografía de gases (GC).                                                                               En este caso se utilizan capilares como columnas, hechos de materiales no adsorbentes y químicamente inertes y la fase móvil no interacciona con las moléculas de la mezcla; su única función es la de transportar la mezcla a estudiar a través de la columna. La diferencia con la cromatografía líquida es que en este caso,  el análisis se encuentra limitado a la volatilidad y la estabilidad térmica de la muestra (no apto para el análisis de proteínas o compuestos biológicos con alto grado de desnaturalización por elevadas temperaturas). Al igual que en la cromatografía líquida, también se puede mejorar la capacidad analítica de la cromatografía de gases con la asociación con la espectrometría de masas, sistema GC-MS

Además de para la investigación química, otras aplicaciones de la cromatografía en sus diferentes vertientes es: análisis alimentario (estudio de la presencia de  aditivos, edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,  fragancias y aromas, aceites, bebidas, ácidos orgánicos, azúcares, ácidos grasos (FAMES)), análisis forense toxicológico (estudio de la presencia de drogas, venenos, alcohol o narcóticos en los fluidos biológicos), análisis de productos de la industria química (aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes) y de contaminantes (fenoles, pesticidas, herbicidas, bifenilos policlorados, parafinas, alcoholes, ácidos orgánicos, aminas,aldehídos y cetonas, ésteres y glicoles), purificación y caracterización de metabolitos, compuestos naturales, enzimas y proteínas.

Y con esto, terminamos el repaso a una de las técnicas analíticas con más variantes, tipologías y asociaciones existentes. He evitado la parte más “analítica” al tratarse de algo más díficil de exponer sin usar un caso práctico y porque considero que, con estas pinceladas sobre la historia y desarrollo de la técnica y su múltiples modalidades, es más que suficiente. Aún así, espero que haya quedado un poco más claro que es la cromatografía, cuáles son sus diferentes tipos y cuál es la principal objetivo de su uso.

¡Nos “leemos” en la próxima entrada!                                                                                TatianaDC

Pd. A destacar también el trabajo divulgativo realizado por Instituto de Química Orgánica General (IQOG, CSIC) en su canal de Youtube (Canal Divulgación) que tiene estos dos vídeos sobre técnicas cromatográficas. Espero que os gusten!!

Fuentes                                                                                                                     http://secyta.es/ http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/principios_de_cromatografia.pdf                    http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cromatografia.pdf https://www.timetoast.com/timelines/historia-de-la-cromatografia https://www.franrzmn.com/tecnicas-de-cromatografia/ http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm             http://www.chromatographyonline.com/                 http://www.chromatographyonline.com/rebirth-chromatography-75-years-ago?id=&sk=&date=&pageID=6                                                                 http://ocw.uc3m.es/ciencia-e-oin/caracterizacion-de-materiales/material-de-clase-1/Tecnicas_de_separacion_cromatografica.pdf http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica%20ambiental/Tema6.pdf             http://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/39/39360/separaciones_por_cromatografia_1.pdf                                 http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html         http://chromatographyscience.blogspot.com.es/p/history_of_chromatography.%20html#.WYcPCIjyjIU                                                           http://es.slideshare.net/arelydlrc/cromatografa-de-particin                                               http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_chromatography http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa

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