Crónica Taller Cegen-PRB2 (II): Aplicaciones del genotipado en la agrigenómica.

Continuando con la crónica de las jornadas organizadas por el nodo norte del Centro Nacional de Genotipado (CEGEN-PRB2) y celebradas el pasado diciembre, he decidido debido a la amplitud de los conceptos a tratar en ella, dejar esta segunda parte de la crónica dedicada a compartir lo expuesto en las diferentes charlas sobre las aplicaciones de la secuenciación de genes y/o el genotipado sobre las líneas de investigación sobre mejora genética realizada sobre los principales animales, legumbres, cereales y frutos de interés comercial, cultivados y/o criados en España a lo largo de las diferentes comunidades autónomas. Así que si quieres saber sobre que productos se habló y que líneas se están siguiendo, ya sabes…sigue leyendo! Agrigenómica

La primera charla que versó sobre la mejora genética en animales fue la impartida por Ana Isabel Fernández, del grupo de mejora genética y conservación de cerdos del INIA (Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Agroalimentaria). En su introducción Ana nos comentó que la mejora genética en cerdos pretende mejorar la calidad de la carne (caracteres productivos), los caracteres reproductivos, su trazabilidad y su conservación. Aunque se pueden usar microsatélites como marcadores anónimos, Genoma cerdogeneralmente se utilizan los SNPs por su elevado número frente a los microsatélites y por la facilidad a la hora de analizarse mediante el uso de chips/arrays de genotipado. Debido a que los caracteres cuantitativos (QTLs) en cerdos son muy complejos (poligenia) y muy abundantes (16,033 QTLs asociados, de los cuales 627 representan un rasgo/carácter determinado), la búsqueda y análisis de genes candidatos es un proceso muy complejo, de gran dificultad y éxito muy limitado. Aumentando el número de recombinaciones alélicas (limitado por el número de recombinaciones posibles en una población) permite asociar con mayor precisión regiones del genoma en los que se observe una mutación causal causante de ese polimorfismo presente en ese QTL de interés. En el caso de la conservación y la trazabilidad en cerdo, está se encuentra determinada por una serie limitada de polimorfismos y alelos/haplotipos específicos conocidos de cada raza y/o población, presentes en genes mitocondriales y nucleares, que pueden utilizarse para identificar los individuos. Ana nos explicó cómo se inició la línea IBMAP de mejora de los cerdos ibéricos (tienen una tasa de prolificidad y de crecimiento menor, debido a la elevada divergencia observada) mediante su cruce con las razas Landrace y Duroc (mejores en lo que a esos caracteres se refiere, menos en lo que a calidad de carne se refiere); se pretendía obtener mediante estudios estructurales genéticos (bandas genómicas en microsatélites) hallar los genes candidatos posicionales (QTL) y funcionales (QTN, nucleótido de caracteres cuantitativos). Uno  los genes QTN observados fue el relacionado con el receptor de la leptina (LEPR c1987 C/T), provocando una redución de la sensación de saciedad al no expresarse lo suficiente para que pueda detectarse la leptina, conllevando a que se deposite más grasa en el tejido muscular (respuesta adaptativa a las condiciones ambientales de la dehesa). Con la primera versión del genoma porcino en 2008, se construyo el primer chip de genotipado masivo (Porcine 60K SNP Chip, Illumina) que permitió además de identificar nuevos QTLs, limitar el número de genes candidatos y por supuesto, establecer el mapa físico y genético (antes era imposible debido al elevado desequilibrio de ligamiento observado). Además del gen del receptor de leptina asociado a la deposición de grasa, se observó que el gen GSK3B contribuye a un mayor rendimiento de la carne del cerdo (favorece la miogenésis y la formación de masa muscular). Luego Ana, también nos habló del proyecto europeo TREASURE, mediante el cual se pretende demostrar la logo-treasuresingularidad de razas locales no aprovechables en la cadena alimentaria, estimando el tamaño poblacional, señales indicativas de eventos demográficos, resistencia a enfermedades, al estrés, etc. Mediante el regenotipado en los chips desarrollados por Affymetrix en 2016 (Axiom® Porcine Genotyping Array) se pretende extraer los genotipos en el mismo sentido de la cadena, en función del mismo valor de MAF (frecuencia del alelo menos común), identificar SNPs comunes y correlacionar los genotipos (concordancia). Aplicado esto al cerdo ibérico se pueden ver que SNP segregan en otras poblaciones para utilizarlos como potenciales marcadores de raza, en este caso, ibérico. En otras poblaciones locales, se observa una mezcla de genotipos procedentes de otras razas fóraneas.

El siguiente ponente, Armand Sánchez del Centro de Investigación de Genómica Agroalimentaria, nos dio un breve repaso sobre las principales plataformas de secuenciación genética y de genotipado: chips de Affymetrix para genotipar la mayoría de las especies domésticas (vaca, salmón, pollo, cerdo, conejos, etc), muchos de ellos surgidos de las primeras versiones de sus genomas correspondientes; plataformas como PacBioPacific Bioscience (permite la secuenciación del microbioma de glándulas mamarias de vacas y de la flora cutánea de perros, que generan graves problemas de salud animal, mediante la formación de lecturas mas largas que favorecen un menor coste y tasa de error) y Oxford Nanopore (favorece una mayor rapidez de obtención de la lecturas y una mayor facilidad en la preparación de las librerías/muestras). Armand se centró en la investigación del fondo genético del microbioma como nueva estrategia de mejora genética. Una de las razones Oxford Nanoporeque dio Armand para impulsar el estudio genético del microbioma es que, además de su elevado número y sus dificultades de estudio y análisis por requerir un ambiente de crecimiento muy específico, presenta un gran impacto metabólico al contribuir en la producción intestinal de ácidos grasos de cadena larga implicados en el sistema inmunitario, a través de la modificación (por cambios en su composición y/o funciones) de la expresión de genes del receptor de tipo Toll que forman parte del sistema imunitario innato (ej: perfiles de microbioma en cerdos infectados por Salmonella son diferentes a los observados en cerdos no infectados) y al incidir de manera muy intensa, en la regulación de la ingesta y el desarrollo de la obesidad. Armand también resaltó el gran avance que supondrá la edición genética vía CRISPR-Cas9 y que ya se está observando en el caso de vacas que crecen sin cuernos, perros más musculados y activos o cerdos resistentes a virus. Incluso Armand, nos habló de la existencia de una nueva disciplina la “fenómica”, aquella que mediante el estudio de datos y características fenotípicas se puedan establecer hipótesis acerca de la verdadera relación entre genes y ambiente (y no al revés, como se viene haciendo habitualmente). Tras esto, Armand dio paso a presentarnos dos de los proyectos de mejora genética en los que trabaja actualmente: Feed-a-gene y PigQSem. En el primero, se está estudiando el impacto del microbioma en la dieta y Logo Feed a genereproducción de los conejos así como en la selección de invididuos más eficientes a nivel productivo, en función del estudio genético poblacional de los mismos y de sus microbiomas. Para ello, se han utilizado chips de Affymentrix donde se han genotipado diferente líneas genéticas seleccionadas a partir de experimentos de dietas restringidas e ingestas a demanda, obteniéndose una serie de datos que han permitido realizar un GWAS preliminar. En el caso de PigQSem, se está tratando de mejorar la base genética que determina la calidad seminal de los cerdos sementales. Factores genéticos (expresión de genes codificantes y no codificantes) modulan los rasgos de calidad del semen porcino, además se cree, que están regulados según leyes mendelianas. Con ello lo que se pretende definir los caracteres genéticos implicados (GWAS, transcripoma y metilomas) y desarrollar protocolos no invasivos de análisis del DNA (paneles de SNPs estudiados mediante chips de genotipado de alta capacidad) para mejorar las técnicas de inseminación. Mediante el cruce de razas Pietrain, se seleccionan los semen para crioperservar y descongelar, estudiando la variabilidad de la motilidad espermática (asociación con cierta región alélica del cromosoma 3 del cerdo, que se corresponde el hombre con genes implicados en la fertilidad y en ratones, en la espermatógenesis) y por otra parte, se estudian los transcriptomas de genes implicados en espermatogenésis. De esto último se llegó a la conclusión de que genes sobreexpresados en semen de baja calidad, se correlacionaban con capacidades de penetración del esperma más pobres.

La tercera charla sobre mejora genética fue impartida por Bernardo Ordovás López, de la Misión Biológica de Galicia (CSIC), quien nos habló sobre el maíz. Comenzó relatándonos la importancia agroalimentaria del maíz, siendo el cereal más cultivado e importado en España y en el mundo, que se caracteriza por una gran variabilidad entre sus líneas puras (al tratarse de especies alógamas). Estas líneas puras se organizan en más de 300 razas, las cuáles se agrupan en 4 grandes grupos cuyo origen parece residir en el sur de México, punto a partir del cual se puede ir observando las distintas migraciones genéticas de estas líneas a lo largo de toda Sudámerica (siendo Variedades MaízMesoamérica y la región andina las que más riqueza alélica presentan), validados histórica y genéticamente. La variabilidad se observa a través las diferencias constatadas en diferentes caracteres genéticos sobre los diferentes grupos de estas líneas que se expanden por casi todo el globo terráqueo. Inicialmente, se trabajaron con isoenzimas como marcadores genéticos que permitían definir y caracterizar la biodiversidad y conservación de las razas locales. Se observó un gran porcentaje de alelos raros, lo que hacía que las zonas con menor variabilidad alélica y mayor diferenciación, sufrieran más riesgo de extinción a menos que, se produjeran más entrecruzamientos e hibridaciones. Esto lo reflejaba bien un trabajo sobre la raza Avati Moroty (maíz más harinoso), donde usando microsatélites en este caso, se observa entre las diferentes variantes, una pérdida de variabilidad (no hay riesgo, pues se encuentra registrados en bancos de germoplasma) y una elevada consanguinidad. Luego dio paso a explicar el cómo el híbrido Corn Belt (cruce de las razas Southern Dent y Northern Flint) desarrollado en EE.UU., es el “padre” de la mayoría de las líneas comerciales de maíz actuales. Por el elevado y repetitivo cruce entre líneas híbridas, se generaba un cuello de botella que resultaba en un patrón heterótico observado en el cruce Stilff y no Stilff. Para evitarlo, se estudió como variaban las líneas puras de las líneas poblacionales locales (derivadas de las primeras) y resultó que se perdían un elevado porcentaje de alelos raros, generados principalmente por la deriva genética originada por el cuello de botella antes explicado. Hoy en día, la mejor forma de crear líneas puras es mediante el reciclaje de líneas ya existentes (el Imagenancestro de las actuales radica en la línea B73) guardadas en el banco de germoplasma. A través del viaje global de las huellas genéticas del maíz, se puede observar que la variedades de India proceden de Sudámerica mientras que las europeas (que se pueden dividir en 3 clúster) proceden de los cruces americanos; en España, las variedades del sur proceden de líneas del Caribe, mientras que las del norte proceden de un grupo mixto, en el que no se ha podido establecer una clasificación clara. Bernardo nos relató que sólo unas pocas variedades han contribuido a las líneas élite europeas modernas, debido en parte al efecto de la deriva genética y a la erosión genética (pérdida de respuesta a largo plazo, generando variables susceptibles a enfermedades, adaptación a la selección natural, etc) y también que algunos de los intentos por conservar la biodiversidad fueron claves para reducir el impacto de hechos históricos catastróficos (ej. períodos de gran hambruna en India en 1943 o la peste de la patata de Irlanda de mitad del siglo XIX). También tocó en su charla el efecto del cambio climático sobre la biodiversidad de especies de interés agroalimentario, destacando el futuro efecto sobre la seguridad alimentaria global y la obligación de mantener los bancos de germoplasmas para ampliar la base genética y reducir la vulnerabilidad genética de las especies más importantes para la industria agroalimentaria. En este caso, desde la Misión Biológica lo que se está trabajando es sobre la selección por floración, uno de los caracteres fenológicos de mayor correlación con la adaptabilidad a los efectos del cambio climático; se utiliza la selección masal por precocidad (floración temprana) que está caracterizado por QTLs de efecto menor. Para identificar genes relacionados con la selección masal por precocidad y ver el efecto de la misma y de la deriva en el genoma, se genotiparon hasta 5000 SNPs de diferentes ciclos de cultivo. Se observaron QTLs asociados a genes de regulación de la floración con frecuencia alélica correspondiente con zonas geográficas delimitadas, encontrándose además próximos a regiones génicas relacionadas con la adatpación a esas regiones y QTLs ortólogos con A. thaliana, en la que se corresponde con señales de respuesta al fotoperíodo.  En Europa se realizan colecciones de variedades locales (96 de las cuales recogen la mayor variabilidad genética, 44  en el caso español), siendo en el caso de las españoles, 3000 variedades las recogidas en Misión Biológica de Galiciavarias colecciones, entre la que destaca la de la Misión Biólogica iniciada en 1921 que consta de 43 razas de colección privada, 83 variedades locales gallegas y 37 variedades de toda España. Por las dificultades de adaptación y/o las diferencias de rendimiento con las líneas élite, es necesario realizar premejoras genéticas con resultados a largo plazo. Se realizan selecciones intra e interpoblacionales entre variantes del norte y del sur, observando las acciones de la selección natural y artificial, las fijación de marcadores genéticos tras varias generaciones, el aumento de la heterosis en los aspectos fenotípicos y la evualación de eficiencia y rendimiento entre híbridos y padres. A través del estudio del genoma, se puede realizar una selección genética a la hora de definir un fenotipo concreto de interés (mayor tamaño del grano, mayor tamaño de la mazorca, mejorar el rendimiento forrajero, etc), tratando de mejorar el efecto de la deriva genética y la selección natural en las variables seleccionadas.

Tras el maíz, llegó la charla sobre otro de los cereales más importantes para la alimentación global: el arroz. En este caso, Concha Domingo Carrasco, del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) nos contó que se está haciendo en España en cuanto a mejora genética del arroz se trata. Aunque parezca algo actual, la mejora genética del arroz se lleva realizando desde 1913 en regiones de cultivo que hoy en día forman parte de Parques Naturales, con protección especial del medioambiente. El arroz por si mismo, puede considerarse una planta modelo: es un alimento básico para más del 40% de la población mundial, su ciclo vital es corto, su genoma no es muy amplio (345 MB), presenta una alta diversidad genética y ya ha sido secuenciado en 2002 (genomas de referencia los de las variedades índica y japónica), lo que permitió que se disponga de una amplia gama de herramientas para su estudio y mejorabases de datos de SNPs, transcriptomas, colecciones de mutantes, RILs, chips de genotipado, poblaciones MAGIC, etc. Hace 10.000 años se originó la primera variedad silvestre (casi homocigota en cuanto a ciertos aspectos se refiere) en la zona del valle del Yangtze en China, siendo images-1rápidamente extendido gracias a la rutas del comercio. Este generó un enorme aumento de la variabilidad genética del arroz, que respondía también a la adaptabilidad a los nuevos hábitats (fotoperíodo) y que explica la gran diferenciación de las variedades índica y japónica. Sólo a través de estudios de asociación genética (GWAS) es cómo se puede aprovechar toda esa variabilidad genética en las líneas de mejora y selección genética. Debido a que la variedad índica es una variedad muy estéril (no hibrida con la variedad japónica), con una maduración muy lenta y con una gran pérdida de caracteres agronómicos adaptativos (tolerancia a la sal, resistencia a patógenos, etc), se trataron de establecer líneas de mejora a nivel local en regiones de clima templado, seleccionando por fotoperiodo y parentales adecuados, que terminó por reducir el acervo genético en las distintas frajas de adaptación. En el caso de España, lo que se trató de buscar los genes reguladores y combinaciones alélicas más favorables para mejorar las variables de España; se seleccionaron 14 variedades japónica representativas de 217 globales, se secuenciaron sus genomas seleccionando los SNPs a genotipar (aproximadamente 2096 SNPs, presentes en más de 3 variedades, bialélicos, distribuidos uniformemente, etc), registrando los fenotipos y elaborando estudios GWAS mediante los cuales se asociaran v4730s19caracteres genómicos de interés. Se observó que cuanto más pequeñas eran las poblaciones mayor el decaimiento del desequilibrio de ligamiento (distancia en el cromosoma en la que el coeficiente de correlación (r2) entre parejas de SNPs cae hasta la mitad) confirmando así su mayor diversidad genética y observándose también, la influencia de la mejora genética realizada desde tiempos más antiguos. El grupo bomba, aunque presentaba un componente asiático, se observaba que procedía de variables de larga antigüedad que habían divergido diferentemente al resto de variables. En otros casos, el resultado de la mejora había generado un cambio en la altura de la planta. De los genes reguladores de la floración, se estudiaron los SNPs y su variación natural entre las diferentes variables, tratando de encontrar las plantas de las variedades con el ciclo más corto. Luego se distribuyeron los alelos en las plantas de ciclos de floración más largos y más cortos, en los 12 pares de cromosomas del arroz para así establecer los mapas de distancias genotípicas.

La penúltima charla de las jornadas de aplicaciones del genotipado en la agrigenómica, fue impartida por Natalia Gutiérrez Leiva, del Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA). Natalia nos relató las líneas de investigación que están realizando en cuanto a mejora genética en habas, una de las leguminosas de mayor interés agroalimentario. Las habas desarrollan una función biológica (retienen el nitrógeno atmosférico), nutricional (alto valor proteico ideal para dietas y/o piensos animales) y medioambientales (claves en la rotación de cultivo para mejorar el estado del suelo y/o reducir las plagas). A pesar de todo esto, el cultivo de estas leguminosas ha ido decreciendo a lo largo del tiempo (por falta de ayudas económicas, fertilizantes, pesticidas autorizados o por plagas), aunque cada vez hay un mayor demanda (España logotipo_y_fotoes el mayor consumidor de toda Europa) y más necesidades de importación. El caso del garbanzo, es al contrario, se importa casi el doble de lo que se produce. Las demandas del sector de establecer semillas certificadas, provoca que se esté trabajando en la detección y manipulación de la variabilidad genética con los objetivos relativos a mejorar la producción de las plantas, la tolerancia a la sequía, salinidad, temperaturas extremas, sus aspectos nutricionales para enriquecer sus capacidades dietoterápicas. El programa de mejorar genéticamente este tipo de leguminosas, las habas, ha acelerado el proceso de mejora tradicional mediante el desarrollo de materiales biológicos por medio de la generación de líneas recombinantes consanguíneas (RILs, procedentes de líneas híbridas de una única semilla) a partir de las cuáles se seleccionan los QTLs de interés según el fenotipo de interés. Del genotipado de marcadores, se realiza el mapa genético y con el fenotipado, se llevan a cabo los estudios de asociación (GWAs) y finalmente se caracterizan los marcadores estudiados en los distintos fondos genéticos. La secuenciación de genotipado ha permitido acelerar mucho la obtención de los mapas genéticos y los estudios de asociación, que antes se realizaba con muchos pasos previos y númerosas dificultades para obtener un resultado óptimo. La mejora genética de las habas se puede abordar desde una perspectiva estructural (mediante el desarrollo de mapas consenso de referencia (usando isoenzimas, microsatélites), que aportan una mayor cobertura de regiones genómicas, nuevos marcadores vinculados a áreas de interés y por supuesto, se ve aumentado el número de polimorfismos en el fondo genético), una perspectiva comparativa (usando el género Medicago como modelo de referencia y expresed sequence tagged sites (ESTS), estableciendo relaciones filogenéticas y evolución de los cromosomas, además de identificar SNPs) y una perspectiva funcional (estudio de los transcriptomas y cuantificación de la expresión de genes de resistencia a ciertas enfermedades) favoreciendo la secuenciación genética del haba, hasta ahora limitado por su alto DNA repetitivo, mal ensamblaje, pocos datos transcriptómicos y un genoma amplio (13000 MB)). A través del estudio de la búsqueda de QTLs implicados en la resistencia de las habas frente a una plaga frente a Ascochyta fabae Speg. usando métodos genómicos y transcriptómicos que saturan regiones QTLs posicionales y funcionales de genes candidatos a la resistencia, se pueden definir y caracterizar intervalos del mapeo genético con seguridad. Otro estudio que están llevando a cabo es caracterizar la base genética del contenido de vicina-convicina de las habas (hidrolizados a divicina e isouramil en el intestino), responsable entre otras cosas del desarrollo del favismo en personas deficientes de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, por su acción de radical libre, y de la baja producción de huevos en la industria avícola. El alelo mutante (low vicine, vc-) reduce el contenido de estos glucósidos exclusivos de la haba, entre unas diez y veinte veces el contenido normal, se cree que es debido a que afecta a la expresión del factor de transcripción del gen de la vicina-convicina; a través de diversas técnicas se ha detectado la presencia del alelo mutante en la parte distal del cromosoma 1 del genoma de la haba.

El último ponente de las jornadas fue Raúl de la Rosa Navarro, procedente del banco mundial de germoplasma del olivo de Córdoba (perteneciente al IFAPA). Raúl, nos habló de la clasificación botánica del olivo (Olea europea L.), la diferencias entre el olivo cultivado, el silvestre y las especies relacionadas pero también, de la distribución tradicional de la variedades actuales como la arbequina (origen catalán) o la picual, así como la existencia de variedades milenarias (no sólo el olivo como árbol) como por ejemplo, la variedad hojiblanca que se remonta a la época del Imperio Romano. Las variedades disponibles en el banco mundial de germoplasma en el que trabaja, proceden de múltiples y variadas regiones (mediterránea, sudamericana, norteamericana, etc), que representan la gran variabilidad genética y fenotípica existente, aspecto de gran importancia a nivel económico y agronómico. Por las sinonimias y homonimias detectadas en la clasificación de las variedades (ej: Picual y Morcona son la misma variedad; Manzanilla de Sevilla, de Montefrío hacen referencia a la misma variedad), es Olivanecesario llevar a cabo la identificación varietal mediante aspectos morfológicos de la hoja, fruto y del hueso pero sobre todo, del genotipado. Antiguamente se estudiaban los marcadores del DNA del olivo por medio de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPDs), polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLPs) y microsatélites (SSR) que permitieron identificar genéticamente el 93% de las variantes existentes a partir sólo de la caracterización de 10 locis (se cree que con 17 locis se puede estudiar la variabilidad genética intracultivar). Problemas en la caracterización del tamaño e identificación de los alelos y en la caracterización filogénica, hicieron que se apostara por la genotipación de alto rendimiento y el uso de SNPs  para diferenciar genéticamente las variedades de olivo, conservar los olivos centenarios (sólo 10 pertenecen a variedades conocidas) y milenarios, identificar las colecciones nucleares (sirve para observar la interacción genotipo – ambiente y para estudiar la interacción entre los caracteres de interés) o certificar las plantas de vivero. Incluso se podría, mediante el estudio de marcadores cloroplásticos, se podría autentificar el origen del aceite de oliva evitando posibles fraudes alimentario-económicos. Mediante la selección asistida por marcadores, se puede mejorar el contenido de tocoferoles en aceites más maduros (más verdes, con más consistencia), la heredabilidad de caracteres del fruto (peso) y calidad del aceite (mediante la descripción de los mapas de ligamiento de los QTLs asociados a la mayor concentración de ácido oleico y linoleico) o resistencia a enfermedades (verticulosis). También es interesante conocer la compatibilidad varietal mediante el test de paternidad con microsatélites, debido a la alta heterocigosidad observada en el olivo que podría explicar ciertos fenotipos inesperados como el observado en la variedad Chiquitita, procedente del cruce de Arbequina por Picual.

Y con este termina esta crónica, doy por terminada esta crónica sobre las jornadas sobre aplicaciones del genotipado a la agrigenómica, organizados por el CEGEN el diciembre pasado. Agradecer a los responsables de esta entidad, la oportunidad brindada para obtener información sobre la investigación genómica en agroalimentación que se está llevando a cabo en España. No vivimos sin comer, así que, espero que desde los organismos competentes en materia de sanidad pública y agroalimentación, se favorezca la investigación en este campo que tanto puede ofrecer a la ciencia agronóma, a la nutrición y al bienestar del ser humano.

¡Nos “leemos” en la próxima entrada!                                                                                     TatianaDC

Link a la primera parte de la crónica: https://unabiologaenlacocina.wordpress.com/2017/01/30/cronica-taller-cegen-prb2-i-aplicaciones-del-genotipado-en-la-agrigenomica/

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