Microscopía electrónica: orígenes y evolución histórica.

Aquí estamos de nuevo con una nueva entrada de carácter histórico. En este caso, se la dedico a la microscopía electrónica, técnica que consta de una grandísima aportación para el estudio, análisis y/u observación de la biología celular y molecular, de la cual considero, que es necesario no sólo saber en que consiste, sino también, quiénes fueron los principales protagonistas que permitieron en su momento su aparición, y que a día de hoy, sea una de las técnicas microscópicas de mayor aplicación en los laboratorios de investigación.

Con la invención del microscopio óptico allá por el 1600 gracias a Zacharias Janssen y posteriormente Antonie van Leeuwenhoek, se abrió la puerta al mundo microscópico, hasta entonces no visible al ojo humano. Lo que no sabían por aquellos días, es que aún existía mucho más allá de todo aquello que se veía o intuía a través de los primeros microscopios ópticos. A partir del 1930, es cuando empezaría a desarrollarse la nueva microscopia: la microscopia electrónica. Con su aparición, se podía profundizar en el conocimiento de los tejidos, las células así como de los componentes más internos de las células, microorgansimos o virus.

Células de la sangre obtenidas a la vista del SEM

El primer hito histórico relacionado con el desarrollo del microscopio electrónico, se remonta hacia el año 1873 cuando, Ernst Karl Abbe con sus estudios sobre el poder de resolución de los microscopios (capacidad de distinguir o separar dos puntos en la imagen que se encuentran muy juntos, inversamente proporcional a la longitud de onda de la fuente de energía utilizada) y Hermann Ludwig Ferdinand von Helmholtz con sus estudios sobre el electromagnetismo, sentaron las bases del futuro desarrollo del microscopio electrónico, aún a pesar de no conocer en esos momentos, la existencia del electrón como partícula sub-atómica. Eso se produciría en el año 1897, cuando Joseph John Thomson (J.J Thomson) a través de sus distintos experimentos en tubos de rayos catódicos, descubrió los electrones, corpúsculo sub-atómico, fundamental en el funcionamiento de los microscopios electrónicos.

No obstante, sería necesaria la entrada en el nuevo siglo XX para que los hitos relacionados con el desarrollo histórico del microscopio electrónico alcanzaran los resultados esperados.

El primer paso fue el realizado por Louis-Victor de Broglie en el año 1924 quién a través de la hipótesis que lleva su nombre, hipótesis de Broglie, establece que los electrones tienen una dualidad como corpúsculo y onda a la vez, sentencia que agilizaba los primeros intentos por llevar a cabo la construcción del primer microscopio electrónico. A diferencia del microscopio óptico, en la microscopia electrónica se utilizan los electrones como fuente de energía, generando una mayor resolución, al poseer los electrones una menor longitud de onda respecto a la observada en la luz visible. Debido a esta nueva concepción de la mecánica cuántica y al continuo desarrollo del nuevo microscopio, el siguiente paso a tratar sería el de evaluación de las lentes que reciben los rayos o haces de electrones y que permiten magnificar la imagen obtenida a través de ellos mismos.

En este punto, fue fundamental la demostración de Hans Busch. Este físico alemán profundizando en sus estudios en materia de óptica electrónica, llegó a proponer en el año 1926, que los electrones sufrían una desviación de su trayectoria debido a la presencia en la misma, de lentes electromagnéticas, siendo dicha desviación, casi idéntica a la sufrida por la luz visible en su paso a través de lentes ópticas. Todos estos conocimientos serían rápidamente utilizados por, los considerados como desarrolladores pioneros del primer microscopio electrónico, Ernst Ruska, Bodo von Borries y Max Knoll.

Ernst Ruska y Max Knoll

Con la ayuda de Knoll, Ruska y von Borries construyeron el año 1933 un microscopio electrónico que, a través de una lente denominada “pole shoe lent” dispuesta en una bobina de hierro hueca y de ancho interior muy pequeño, permitía comprimir el campo magnético y favorecer la desviación de los electrones, dando como resultado una amplificación de más de 1200 veces el tamaño de muestra original. En 1937, la compañía Siemens comenzó a comercializar los primeros microscopios de transmisión surgidos de este microscopio desarrollado por Ruska y von Borries.

El microscopio electrónico de transmisión (TEM en inglés) es un microscopio que permite observar muestras de grosor ultrafino (no superior a 1-2 micras). Esto es así debido a que, se obtiene la imagen por el paso de los electrones a través de la muestra (ésta se sitúa entre la lente condensadora y la objetivo); la resolución final alcanzada se encuentra  entre los 0.14 a los 0.23 nanómetros.

Microscopio de transmisión

El microscopio electrónico de transmisión consta de un cañón electrónico (con una fuente de alto voltaje, un cátodo y un ánodo) dispuesto en la parte superior, un sistema de vacío, una serie de lentes electromagnéticas (condensadora, objetivo e intermedia;  que condensan el haz de electrones, forman la imagen y proyectan la imagen o permiten variar los aumentos, respectivamente), una pantalla fluorescente y un sistema de registro. A diferencia del microscopio óptico, no se utilizan tinciones para la observación de las muestras, sino que la visualización tiene lugar por medio de la generación de contraste (contraste negativo o por método indirecto). La imagen final que se obtiene, depende del grado de dispersión o no de los electrones que atraviesan la muestra (campo oscuro o campo claro respectivamente) y ofrece información estructural de la muestra. La resolución de este microscopio es directamente proporcional al valor de voltaje introducido en el cañón electrónico e inversamente proporcional al contraste utilizado en la tinción y al grosor de las muestras.

Simultáneamente a la aparición de este microscopio electrónico de transmisión, se comenzó a desarrollar el microscopio electrónico de barrido. En 1937 Manfred Von Ardenne inventa el microscopio electrónico de barrido, con el que conseguía mejorar la resolución del microscopio de transmisión propuesto por Ruska y colaboradores pero del que, aún sería necesario realizar numerosas mejoras. Éstas, fueron llevadas a cabo por grupos de investigación de la Universidad de Cambridge, apareciendo en el año 1965, el modelo “Stereoscan“, el primer microscopio electrónico de barrido comercial. De este modelo “Stereoscan” surgieron múltiples mejoras futuras, siendo una de ellas el desarrollo del microscopio electrónico de barrido efecto túnel (STM en inglés) por parte de Heinrich Rohrer y Gerd Binnig en 1981.

El microscopio electrónico de barrido (SEM en inglés) es un microscopio electrónico que permite observar la superficie de las muestras que sólo deben de cumplir el requisito de ser conductoras (por lo que es habitual la cobertura de la muestra con metales conductores como el oro). La imagen se obtiene debido a la detección de los electrones “devueltos” de la muestra, posteriormente al impacto de los electrones proyectados desde el cañón electrónico; se generan imágenes con una resolución entre 4 a 20 nanómetros y una gran profundidad de campo (permite distinguir los más mínimos detalles). 

Microscopio de barrido

Los electrones procedentes del cañón electrónico, atraviesan la lente condensadora y objetivoincidiendo sobre la muestra, sin llegar a atravesar la, produciendo tras la interacción con los átomos de la muestra una serie de efectos que desencadenan la liberación o “devolución” de electrones secundarios, retrodispersados, tipo Auger o rayos X a partir de la muestra y en respuesta a esos efectos desencadenados en la misma. Estos electrones liberados o devueltos, son recogidos en un detector que contiene lentes electromagnéticas (electroimanes), encargados de formar la imagen final en el sistema de registro. Para generar el barrido sobre la superficie de la muestra, este microscopio electrónico contiene un deflector que distribuye el haz de electrones, permitiendo el recorrido de los electrones punto por punto o línea por línea de la muestra a observar. El haz de electrones que incide sobre la muestra debe de ser muy pequeño (de ahí que la lente condensadora y objetivo se encuentren por encima de la muestra) ya que el mayor valor de de resolución se alcanza cuanto menor sea el haz de electrones. La imagen que se obtiene al final, es de carácter tridimensional, facilitando información sobre las estructuras, texturas y/o morfología de las muestras observadas.

Hasta los años 1960, la microscopía electrónica en el campo de la biología celular servía para realizar análisis de carácter cualititativo fundamentalmente y las imágenes obtenidas no estaban exentas de artefactos o aberraciones ópticas. Es, a partir del trabajo realizado por Aaron Klug, Donald Caspar y John Finch sobre la estructura icosaédrica de los virus (fundamentalmente el virus del mosaico del tabaco), cómo se establecen los primeros análisis estructurales que utilizaban como principal herramienta, la microscopia electrónica.

Los estudios realizados mediante microscopía electrónica con virus icosaédricos y helicoidales sirvieron a A. Klug y colaboradores, para desarrollar la teoría de la formación de la imagen, que servía para comprender que es lo que realmente se observa en un microscopio electrónico (ej. imágenes de muestras con contraste negativo) y para posteriormente, desarrollar procedimientos de reconstrucción tridimensional de grandes complejos macromoleculares basados en otras técnicas, como la de difracción de rayos X (sobre todo en complejos macromoleculares no son susceptibles de ser analizados estructuralmente con esta técnica) y modelos matemáticos como la transformada de Fourier.  A través de todo ello, se conseguía mostrar la potencialidad de la microscopía electrónica para determinar estructuras a cualquier resolución, sin utilizar metales pesados para aumentar el contraste (el número atómico bajo de la mayoría de muestras biológicas no proporciona por si misma un buen contraste).

Y hasta aquí dejo por hoy, mi particular y humilde homenaje al desarrollo histórico de la microscopía electrónica. Para la próxima ya trataré en profundidad el desarrollo histórico de las técnicas de preparación (inclusión, corte y tinción) de las muestras que se observan por medio de las técnicas microscópicas.

Nos “leemos” en la próxima entrada!

TatianaDC

Fuentes

Valpuesta J.M. “A la búsqueda del secreto de la vida. Una breve historia de la biología molecular” Editorial Hélice 2008 ; Vázquez Nin G. Echeverría, O. “Introducción a la Microscopía electrónica aplicada a las ciencias biológicas” UAMM Edición 2000.  Bozzola, JJ.,Rusell L.D. “Electron microscopy” Second Edition Editorial Jones & Bartlett Learning, 1999 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physics http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1982/klug-lecture.html http://www.scai.uma.es/servicios/area_microscopia/area_microscopia.html http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_electr%C3%B3nico

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