Cronología histórica de los avances en técnicas y medios de cultivo celular.

Siguiendo con la dinámica de otras entradas dedicadas a técnicas o procedimientos habitualmente realizados en los laboratorios de investigación, hoy toca dedicarle una a las mejoras, históricamente introducidas, en la técnica de cultivo celular (conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de células in vitro, preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas) y en la fabricación de medios de cultivo celular. Sin duda resultaron y resultan muy importantes, puesto que, estos cultivos celulares son óptimos para trabajos de investigación básica, estudios de ingeniería genética y/o producción de compuestos biológicos como, por ejemplo, vacunas virales.

Cultivo celular

El primer investigador en darse cuenta de la gran potencialidad del cultivo celular como técnica de mantenimiento de células in vitro, fue Wilhem Roux, embriólogo alemán quién, en 1885, cultivó células de embrión de pollo en solución salina durante días. Con este experimento, demostró que las células embrionarias podían sobrevivir sin requerir la presencia de un organismo que las mantuviera vivas en su interior. Esto llevó a que, en el siglo XX, se desarrollara esta técnica con el fin de dar una explicación a los procesos fisiológicos, destacando en este aspecto, los trabajos del zoólogo americano Ross Granville Harrison sobre cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios para explicar la formación del axón de las neuronas.

A pesar de estos avances iniciales, existía una gran limitación inicial: los cultivos celulares hasta entonces utilizados, no disponían de medios nutritivos adecuados para la propagación de las células en dicho cultivo. Gracias a la labor realizada por M. Burrows, esta limitación dejó de ser un problema. Burrows descubrió que el plasma era un nutriente esencial en los medios de cultivo, siendo además éstos, óptimos para la propagación de células de diversos tejidos celulares en condiciones in vitro. Otros investigadores que realizaron trabajos de cara a la mejora de la técnica de cultivo celular, serían Prous y Jones, primeros en utilizar la tripsina para disgregar las células y permitir así constituir el primer cultivo celular propiamente dicho. Sin embargo, aún no se lograban eliminar otras limitaciones como la poca viabilidad y las elevadas contaminaciones que se producían en los medios. Pronto serían solventadas, gracias al trabajo realizado por Alexis Carrel que junto con M. Burrows, añadiría a los medios de cultivo factores de crecimiento mejorando su función nutricional siendo clave también, el desarrollo del conocido frasco de Carrel, esencial para evitar las contaminaciones microbianas que se producían habitualmente y con ello, garantizar el éxito de la propagación de las células en cultivo in vitro.

Frasco de Carrel

Otros avances reseñables de la técnica de cultivo celular fueron, uno en 1949 cuando Alan Parks fija las condiciones de congelación de los cultivos celulares en nitrógeno líquido para evitar la pérdida de viabilidad celular y, otro en 1952, cuando Scherer, Syrventon y Gey consiguen desarrollar la primera línea celular, la conocida como células HeLa que, aunque inicialmente se utilizó para el estudio de virus de la poliomelitis, hoy en día es una de las líneas celulares con mayor aplicación biomédica. También es necesario recordar los trabajos de Rita Levi-Montalcini sobre la estimulación propiciada por factores de crecimiento nervioso, de los investigadores L. Hayflick y P. S. Mooheart sobre las lineas celulares finitas de fibroblastos, o las líneas celulares productoras de anticuerpos 

Todos estos avances hacen referencia a la técnica de cultivo celular en diferentes vertientes pero, no debemos olvidarnos de los avances producidos en cuanto a la mejora de los medios de cultivo, principales factores implicados en el mayor o menor éxito del cultivo de células in vitro. Cada tipo de cultivo celular requiere un medio de cultivo específico, sin que exista una fórmula universal y precisa para ello. Los primeros medios de cultivo consistían en suero sanguíneo, plasma y linfa. A través de los trabajos de Burrows, Carrel y Levi-Montalcini se establecieron los factores de crecimiento como requerimientos nutricionales fundamentales en los medios de cultivo, apareciendo así los primeros medios de cultivo sintéticos. En 1950, destacó el diseñado por Morgan conocido como “medio 199” y que contenía hasta un total de 61 nutrientes sintéticos y entre un 5-10% de suero fetal bovino.

Sin embargo, la gran revolución en cuanto a avance en medios de cultivo se refiere, vino de la mano de Eagle y sus investigaciones sobre los requerimientos nutricionales presentes en el cultivo de células HeLa y células L (de ratón) en cultivo. A través de ellos, consiguió definir 28 sustancias esenciales para dicho desarrollo y mantenimiento in vitro, siendo las más importantes la glucosa, los aminoácidos precursores de proteínas, las vitaminas, los sales minerales y las soluciones corporales complejas (suero) en mínimas cantidades (aproximadante 1%). A partir de este hallazgo, Eagle consiguió desarrollar dos medios de cultivo ampliamente conocidos y usados habitualmente: 

a) medio basal de Eagle (MBE), medio semi-sintético que contiene además de glucosa, 13 aminoácidos precursores de proteínas, 8 vitaminas y 6 sales minerales que actuarán como cofactores metabólicos, buffers para el mantenimiento del pH y del balance eléctrico y suero fetal bovino (BSF) como principal portador de factores de crecimiento y fibronectina, esenciales para la adhesión, división y visibilidad de las células.

b) medio Eagle mínimo esencial (EMEM), medio similar al MBE pero con una mayor concentración de de aminoácidos precursores de proteínas y vitaminas. Con este medio se consigue un mayor mantenimiento de las células in vitro, sin requerir de renovaciones o cambios del medio de cultivo durante un período de tiempo.

Cultivos celulares

Además de estos medios básicos, encontramos los medios desarrollados por Ham en 1965, responsable de introducir los medios de cultivo definidos libres de suero capaces de mantener células de mamífero en cultivo in vitro indefinidamente y, las soluciones balanceadas (SSB) de J.H. Hanks y W.R Earle (conocidos como medios de mantenimiento) que son utilizadas como diluyentes de los nutrientes del medio de cultivo y permiten mantener el pH y presión osmótica del medio en unos valores concretos, así como, a las células en cultivo durante períodos de tiempo cortos. Debemos diferenciar entre, la SSB de Hanks que se utiliza para incubar cultivos en sistemas cerrados y la SSB de Earle que se utiliza para incubar cultivos en atmósferas a 5% de CO2. Estas soluciones además de iones (Na, Ca, Mg, Cl, P, K), azúcares, aminoácidos, vitaminas y minerales contiene elementos adicionales como hierro, zinc y selenio así como antibióticos y antimicóticos.

En resumen, un buen medio de cultivo será áquel que reúna las siguientes cualidades: especificidad respecto a la célula a cultivar, carácter nutritivo, con valores de pH adecuado, capacidad de buffer, isotónico y por supuesto, estéril. Hoy en día, numerosas compañías comerciales producen diferentes medios de cultivo en función de su especificidad de uso, la re-formulación o mezcla balanceada de otro medio existe, la presencia o no de antibióticos o según las densidades de propagación celular deseadas, entre otras cosas.

Nos leemos en la siguiente entrada!

TatianaDC

Fuentes

GIL-LOYZAGA, P. E. “Cultivo de células animales y humanas. Aplicaciones en Medicina Regenerativa” Cap. 1. Editorial Visión Libros  ; HERRERO URIBE, L. “Procedimientos en Virología Médica” Cap. 4. Editorial Universidad de Costa Rica. 2004  ;  SEGURA-CAMPOS, M.; CHEL GUERRERO, L. ; BETANCOUR ANCONA, D. “Bioactividad de péptidos derivados de proteínas alimentarias” pp 33-35. Editorial Omnia Science

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/ecacc-handbook.html

http://www.protocol-online.org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture/index.html

http: //www.ibiantech.com

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